Том 42, № 4 (2025)

В экспериментах на изолированных митохондриях печени крыс показано, что пируват (10–30 мМ) в присутствии L-глутамата вызывает концентрационно-зависимое ингибирование дыхания, активированного ADP. Дыхание реактивируется 3 мМ L-малата. Оба эффекта воспроизводятся в присутствии D,L-ацетилкарнитина (АсCar), что указывает на важную роль ацетилКоА (AcCoA) в регуляции реакций цикла Кребса. При окислении пирувата скорость дыхания снижается в течение нескольких сотен секунд. Эффект воспроизводится в присутствии дихлорацетата (DCA), ингибитора киназы пируватдегидрогеназы (PDK) и не наблюдается при избытке АсCar, что указывает на дефосфорилирование пируватдегидрогеназы (PDH) при ингибировании PDK пируватом (+ADP) или DCA. Эффекты пирувата и АсСar зависят от времени преинкубации митохондрий в состоянии 2. Эксперименты на замороженных/размороженных митохондриях показывают, что преинкубация митохондрий с пируватом восстанавливает активность PDH и подавляет активность α-кетоглутаратдегидрогеназы (α-KGDH), регистрируемых по флуоресценции NADH. Таким образом, в качестве возможного механизма ингибирования дыхания пируватом можно предположить комбинированный механизм, сочетающий 1) аллостерическое ингибирование цитратсинтазы избытком AcCoA при низких концентрациях оксалоацетата и α-KGDH с возможным участием ацетоацетилКоА; 2) медленное ацетилирование α-KGDH и других ферментов цикла избытком AcCoA при медленной реактивации PDH пируватом.

Клетки микроглии в мозге рассматриваются в качестве резидентных макрофагов, обладающих рядом функциональных и физиологических характеристик, свойственных для указанных иммунных клеток. Микроглия вовлечена в реализацию процессов нейровоспаления различной этиологии, в ходе которых она подвержена фенотипическим изменениям. В нейрон-глиальных культурах для клеток микроглии свойственна низкая пролиферативная способность ввиду отсутствия необходимых ростовых факторов. В рамках данного исследования мы оценили влияние комбинации критических для пролиферации микроглии соединений, таких как трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF) и холестерин, на количество и функциональную активность клеток микроглии в культурах гиппокампа новорожденных крыс. Нами было установлено, что комбинация TGFβ+MCSF+холестерин увеличивала количество клеток микроглии в культурах более чем в два раза. Методом ПЦР-анализа в реальном времени было показано, что воздействие провоспалительного агента липополисахарида (ЛПС) на культуры, выращенные с использованием этой комбинации факторов, приводило к усилению экспрессии генов, кодирующих ассоциированные с воспалением белки, такие как IL-1β, TNFα, STAT3. Кроме того, ЛПС усиливал экспрессию гена, кодирующего белок виментин, выступающий в качестве ситуативного маркера реактивной микроглии. Наряду с этим инкубация с ЛПС приводила к увеличению клеточной гибели в культурах. В случае воздействия эпизода гипоксии отмечалось подавление экспрессии генов, кодирующих указанные провоспалительные белки, при этом усиление клеточной гибели по сравнению с контролем было незначительным. ЛПС, а также хемотаксический формилированный пептид (активатор иммунных клеток), вызывали в клетках микроглии усиление продукции супероксид-аниона и повышение внутриклеточной концентрации Ca²⁺. Таким образом, описанные эффекты ЛПС могут свидетельствовать в пользу того, что комбинация TGFβ+MCSF+холестерин, вносимая в среду для культивирования, способствует сохранению и пролиферации в нейрон-глиальных культурах клеток функционально активной микроглии.

Трансдукция многих агонистов включает мобилизацию внутриклеточного Са²⁺. Динамика и форма внутриклеточных Са²⁺-сигналов детерминируются Са²⁺-потоками через плазмалемму и мембраны внутриклеточных органелл, прежде всего, эндоплазматического ретикулума (ЭР). Хотя традиционно механизмы внутриклеточной Са²⁺-сигнализации исследовались с использованием химических флуоресцентных Са²⁺-зондов, появление генетически кодируемых Са²⁺-сенсоров с различной внутриклеточной локализацией существенно расширило инструментальные возможности. В настоящей работе в клетках НЕК-293 проводился синхронный мониторинг цитозольного Са²⁺ с использованием Fluo-8 и ретикулярного Са²⁺ с помощью генетически кодируемого Са²⁺-сенсора R-CEPIA1er с локализацией в ЭР. При импульсной стимуляции клеток ацетилхолином (ACh) наблюдались скоординированные рост цитозольного Са²⁺ и падение Са²⁺ в ЭР на передней фазе Са²⁺-ответа, релаксация которых часто сопровождалась наложенными колебаниями. Большую детализацию скоррелированного поведения концентрации цитозольного Са²⁺ (С) и ретикулярного Ca²⁺ (C_s) могло дать представление клеточных ответов на фазовой плоскости (C_s, C). Поскольку C_s и C не измеряются непосредственно, а измеряются Ca²⁺-зависимые интенсивности флуоресценции Са²⁺-зондов, экспериментальные данные представлялись в плоскости (F_s, F_c), где F_s и F_с равны ΔF/F₀ для R-CEPIA1er и Fluo-8 соответственно, что эквивалентно представлению в плоскости (C_s, C). Фазовые траектории свидетельствовали о том, что Са²⁺-ответы на ACh не могли быть сгенерированы исключительно за счет обмена Са²⁺ между гомогенным Cа²⁺-депо и цитозолем, поскольку в ~30% случаев фазовая траектория содержала петлю с участком одновременного роста C_s и C. Петля наблюдалась и при подавлении входа Са²⁺, что указывало на участие внутриклеточного источника Са²⁺, недоступного для мониторинга с помощью R-CEPIA1er или не вносящего существенного вклада в его флуоресценцию. Ингибиторный анализ показал, что этим источником не являются кислые эндосомы и лизосомы, содержащие двупоровые каналы, аппарат Гольджи и везикулы, куда Са²⁺ загружается ATP-азой SPCA-типа, органеллы, высвобождающие Са²⁺ через рианодиновые рецепторы, и митохондрии, из матрикса которых Са²⁺ выбрасывается в цитозоль Na⁺/Ca²⁺-обменником. Полученные результаты в целом указывают на более сложную систему генерации агонист-индуцированных Са²⁺-сигналов, чем в парадигме с одним гомогенным пулом запасенного Са²⁺.