Эффективный метод выделения высококачественной РНК из мицелия токсигенных грибов Fusarium sp.

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Разработан быстрый и относительно недорогостоящий метод выделения и очистки РНК из мицелия двух видов фитопатогенных грибов рода Fusarium: F. graminearum и F. coffeatum, – обладающих различными морфологическими и биохимическими характеристиками. Метод включает использование буфера на основе гуанидин гидрохлорида и спин-колонок, входящих в состав коммерческого набора для выделения плазмидной ДНК, и применим при работе как с мицелиями, выращенными на агаризованных питательных средах, так и с жидкими культурами грибов. Выход РНК, полученной с использованием предложенного протокола, составил 4–14 мкг/100 мг веса мицелия при значениях индекса целостности РНК (RIN) до 8.4. В процессе оптимизации метода рекомендована предварительная лиофилизация образцов при работе с жидкими культурами, а также использование ингибитора РНКаз при выделении из культур на поздних этапах роста.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. А. Стахеев

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

Д. Ю. Рязанцев

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

Н. Г. Габриелян

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

А. В. Полубояринова

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

М. Е. Тальянский

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

С. К. Завриев

Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: stakheev.aa@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Fones H.N., Bebber D.P., Chaloner T.M., Kay W.T., Steinberg G., Gurr S.J. (2020) Threats to global food security from emerging fungal and oomycete crop pathogens. Nat. Food. 1(6), 332–342.
  2. Summerell B.A., Laurence M.H., Liew E.C.Y., Leslie J.F. (2010) Biogeography and phylogeography of Fusarium: a review. Fungal Divers. 44, 3–13.
  3. Ekwomadu T.I., Mwanza M. (2023) Fusarium fungi pathogens, identification, adverse effects, disease management, and global food security: a review of the latest research. Agriculture. 13(9), 1810.
  4. Kamle M., Mahato D.K., Gupta A., Pandhi S., Sharma B., Dhawan K., Vasundhara, Mishra S., Kumar M., Tripathi A.D., Rasane P., Selvakumar R., Kumar A., Gamlath S., Kumar P. (2022) Deoxynivalenol: an overview on occurrence, chemistry, biosynthesis, health effects and its detection, management and control strategies in food and feed. Microbiol. Res. 13, 292–314.
  5. Ropejko K., Twarużek M. (2021) Zearalenone and its metabolites – general overview, occurrence and toxicity. Toxins. 13, 35.
  6. Qu L., Wang L., Ji H., Fang Y., Lei P., Zhang X., Jin L., Sun D., Dong H. (2022) Toxic mechanism and biological detoxification of fumonisins. Toxins. 14, 182.
  7. Langevin F., Eudes F., Comaeu A. (2004) Effect of trichothecenes produced by Fusarium graminearum during Fusarium head blight development in six cereal samples. Eur. J. Plant Pathol. 110(7), 735–746.
  8. Merhej J., Richard-Forget F., Barreau C. (2011) Regulation of trichothecene biosynthesis in Fusarium: recent advances and new insights. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91(3), 519–528.
  9. Woloshuk C.P., Shim W.-B. (2013) Aflatoxins, fumonisins and trichothecenes: a convergence of knowledge. FEMS Microbiol. Rev. 37(1), 94–109.
  10. Gil-Serna J., Vázquez C., Patiño B. (2020) Genetic regulation of aflatoxin, ochratoxin A, trichothecene, and fumonisin biosynthesis: a review. Int. Microbiol. 23(1), 89–96.
  11. Kolawole O., Meneely J., Petchkongkaew A., Elliott C. (2021) A review of mycotoxin biosynthetic pathways: associated genes and their expressions under the influence of climatic factors. Fungal Biol. Rev. 37(1), 8–26.
  12. Yang B., Wang Y., Tian M., Dai K., Zheng W., Liu Z., Yang S., Liu X., Shi D., Zhang H., Wang Y., Ye W., Wang Y. (2021) Fg12 ribonuclease secretion contributes to Fusarium graminearum virulence and induces plant cell death. J. Integr. Plant Biol. 63(2), 365–377.
  13. Qian H., Wang L., Wang B., Liang W. (2022) The secreted ribonuclease T2 protein FoRnt2 contributes to Fusarium oxysporum virulence. Mol. Plant Pathol. 23(9), 1346–1360.
  14. Ульянова В.В., Ваньков П.Ю., Зеленихин П.В., Шах Махмуд Р., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. (2020) Секретируемые щелочные рибонуклеазы микромицетов. Ученые записки Казанского университета. Серия: естественные науки. 162(3), 335–349.
  15. Hansch C., McKarns S.C., Smith C.J., Doolitle D.J. (2000) Comparative QSAR evidence for a free-radical mechanism of phenol-induced toxicity. Chem. Biol. Interact. 127(1), 61–72.
  16. Sridar N., Krishnakishore C., Sandeep Y., Sriramnaveen P., Manjusha Y., Sivakumar V. (2011) Chloroform poisoning – a case report. Ren. Fail. 33(10), 1037–1039.
  17. Yaffe H., Buxdorf K., Shapira I., Ein-Gedi S., Moyal-Ben Zvi M., Fridman E., Moshelion M., Levi M. (2012) LogSpin: a simple, economical and fast method for RNA isolation from infected or healthy plants and other eukaryotic tissues. BMC Res. Notes. 5, 45.
  18. Минаева Л.П., Самохвалова Л.В., Завриев С.К., Стахеев А.А. (2022) Первое выявление гриба Fusarium coffeatum на территории Российской Федерации. Сельскохозяйственная биология. 57(1), 131–140.
  19. Farber J.M., Sanders G.W. (1986) Fusarin C production by North American isolates of Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 51(2), 381–384.
  20. Stakheev A.A., Erokhin D.V., Meleshchuk E.A., Mikityuk O.D., Statsyuk N.V. (2022) Effect of compactin on the mycotoxin production and expression of related biosynthetic and regulatory genes in toxigenic Fusarium culmorum. Microorganisms. 10, 1347.
  21. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Witter C.T. (2009) The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR. Clin. Chem. 55(4), 611–622.
  22. Shcherbakova L., Mikityuk O., Arslanova L., Stakheev A., Erokhin D., Zavriev S., Dzhavakhiya V. (2021) Studying the ability of thymol to improve fungicidal effects of tebuconazole and difenoconazole against some plant pathogenic fungi in seed or foliar treatments. Front. Microbiol. 12, 629429.
  23. Sánchez-Rodríguez A., Portal O., Rojas L.E., Ocaña B., Mendoza M., Acosta M., Jiménez E., Höfte M. (2008) An efficient method of high-quality fungal total RNA to study the Mycosphaerella fijiensis-Musa spp. interaction. Mol. Biotechnol. 40(3), 299–305.
  24. Delira-Argumedo R., González-Mendoza D., Alarcón A. (2008) A rapid and versatile method for the isolation of total RNA from the filamentous fungus Trichoderma sp. Ann. Microbiol. 58(4), 761–763.
  25. Bernáldez V., Rodríguez A., Rodríguez M., Sánchez-Montero L., Córdoba J.J. (2017) Evaluation of different RNA extraction methods of filamentous fungi in various food matrices. LWT. 78(6), 47–53. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2016.12.018
  26. Tu Q., Wang L., An Q., Shuai J., Xia X., Dong Y., Zhang X., Li G., He Y. (2023) Comparative transcriptomics identifies the key in planta-expressed genes Fusarium graminearum during infection of wheat varieties. Front. Genet. 14, 1166832.
  27. Miguel-Rojas C., Cavinder B., Townsend J.P., Trail F. (2023) Comparative transcriptomics of Fusarium graminearum and Magnaporthe oryzae spore germination leading up to infection. mBio. 14(1), e0244222.
  28. Zhang L., Zhou X., Li P., Wang Y., Hu Q., Shang Y., Chen Y., Zhu X., Feng H., Zhang C. (2023) Transcriptome profile of Fusarium graminearum treated by putrescine. J. Fungi. 9, 60.
  29. Schumann U., Smith N.A., Wang M.-B. (2013) A fast and efficient method for preparation of high-quality RNA from fungal mycelia. BMC Res. Notes. 6, 71.
  30. Shu C., Sun S., Chen J., Chen J., Zhou E. (2014) Comparison of different methods for total RNA extraction from sclerotia of Rhizoctonia solani. Electron. J. Biotechnol. 17(1), 50–54.
  31. Logemann J., Schell J., Willmitzer L. (1987) Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163(1), 16–20.
  32. Pearson G., Lago-Leston A., Valente M., Serrão E. (2006) Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur. J. Phycol. 41(1), 97–104.
  33. García-Baldenegro C.V., Vargas-Arispuro I., Islas-Osuna M., Rivera-Domínguez M., Aispuro-Hernández E., Martínez-Téllez M.A. (2015) Total RNA quality of lyophilized and cryopreserved dormant grapevine buds. Electron. J. Biotechnol. 18, 50–54.
  34. Damsteegt E.L., McHugh N., Lokman P.M. (2016) Storage by lyophilization – resulting RNA quality is tissue dependent. Anal. Biochem. 511, 92–96.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Результаты анализа целостности РНК F. graminearum (а) и F. coffeatum (б), выполненного на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer (“Agilent Technologies”, США). РНК выделена из мицелиев грибов на 4 сутки роста на жидкой питательной среде.

Скачать (298KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма образцов РНК, выделенных из мицелиев грибов на 7 сутки роста на жидких питательных средах. Слева от маркера (М) – образцы, выделенные без ингибитора РНКаз RiboCare, справа – с добавлением ингибитора. 1, 5 – F. graminearum, набор RNeasy Plant Mini Kit; 2, 6 – F. graminearum, метод с использованием 8 М гуанидин гидрохлорида; 3, 7 – F. coffeatum, набор RNeasy Plant Mini Kit; 4, 8 – F. coffeatum, метод с использованием 8 М гуанидин гидрохлорида.

Скачать (96KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Графики зависимости пороговых циклов ПЦР от степени разведения кДНК F. graminearum (а) и F. coffeatum (б). Рядом с каждой точкой указана величина SD.

Скачать (95KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025